بررسی نحوه عملکرد میکروسکوپ الکترونی

به گزارش خبرنگار حوزه دریچه فناوری گروه فضای مجازی اخبار ، میکروسکوپ های الکترونی، نوعی میکروسکوپ مرکب محسوب می شود که از ترکیب حداقل دو عدسی بوجود آمده است و به جای نور مرئی از الکترون استفاده می‌‌کند. میکروسکوپ‌های الکترونی از الکترومگنت‌ها به عنوان عدسی عمل کمک می گیرد که سیستم، کاملا درون خلاء قرار دارد و برای مشاهده‌ی سلول‌ها و ساختار‌های سلولی، به جای نور مرئی از الکترون استفاده می‌کنند.

سیر تحولی و رشد میکروسکوپ الکترونی

جالب است بدانید؛ میکروسکوپ‌های اولیه که میکروسکوپ ساده نام داشت، شامل تنها یک عدسی بودند، اما میکروسکوپ الکترونی، که میکروسکوپ مرکب است از ترکیب حداقل دو عدسی بوجود آمده است.

در طول قرن هیجدهم میکروسکوپ در زمره وسایل تفریحی به شمار می‌آمد. با پژوهش‌های بیشتر پیشرفت‌های قابل توجهی در شیوه ساختن عدسی شئی حاصل شد،  بطوری که عدسی‌های دیگر یصورت ذره بین‌های معمولی نبودند بلکه خطا‌های موجود در آن‌ها که به کنج‌هایی معروف هستند، دفع شده‌اند و آن‌ها می‌توانستند جرئیات یک شی را دقیقا نشان دهند. پس از آن در طی پنجاه سال، پژوهشگران بسیاری تلاش کردند تا بر کیفیت و مرغوبیت این وسیله بیافزایند. بالاخره ارنست آبه توانست مبنای علمی میزان بزرگنمایی میکروسکوپ را تعریف کند. بدین ترتیب میزان بزرگنمایی مفید آن بین ۵۰ تا ۲۰۰۰ برابر مشخص شد. البته می‌توان میکروسکوپ‌هایی با بزرگنمایی بیش از ۲۰۰۰ برابر ساخت. مثلا قدرت عدسی چشمی را بیشتر کرد.

اما قدرت تفکیک نور ثابت است و درنتیجه حتی بزرگنمایی بیشتر می‌تواند دو نقطه از یک شی را بهتر تفکیک کند. هر چه بزرگنمایی شی افزایش یابد به میزان پیچیدگی آن افزوده می‌شود.

بزرگنمایی شی در میکروسکوپ‌های تحقیقاتی جدید معمولا ۳X، ۶X، ۱۰X، ۱۲X، ۴۰X و ۱۰۰X است و در نتیجه بزرگنمایی در این میکروسکوپ بین ۱۸ تا ۱۵۰۰ برابر است. چون بزرگنمایی میکروسکوپ نوری از محدوده معینی تجاوز نمی‌کند برای بررسی بسیاری از پدیده‌هایی که احتیاج به بزرگنمایی خیلی بیشتر دارند مفید است. تحقیقات بسیاری صورت گرفت تا وسیله دقیق تری با بزرگنمایی بیشتر ساخته شود. نتیجه این پژوهش‌ها منجر به ساختن میکروسکوپ الکترونی شد.

 میکروسکوپ الکترونی چه اطلاعاتی ارائه می‌دهد؟!

• توپوگرافی شی (نقشه برداری): در این کار با آشکار کردن مشخصات سطح و بافت داخلی شی، می‌توان به خواصی مانند سفتی و میزان ارتجاعی بودن آن پی برد.
• مورفولوژی (زیست شناسی): به دلیل اینکه در این رویت شکل و سایر ذرات مشخص است، می‌توان به نیروی استحکام پی برد.
• ترکیب: این میکروسکوپ می‌تواند عناصر سازنده شی را مشخص کند؛ بنابراین می‌توان به خواصی مانند نقطه ذوب، اکتیویته شی دست یافت.
• بلور شناسی: میکروسکوپ الکترونی چگونگی چیده شدن اتم را در مجاورت یکدیگر نشان می‌دهد. به این ترتیب می‌توان آن‌ها را از نظر رسانایی و خواص الکتریکی بررسی نمود.

معرفی انواع میکروسکوپ الکترونی

میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM)

در این میکروسکوپ نمونه را در نوعی پلاستیک، قالب گیری کرده و سپس با تیغ الماسی یا شیشه‌ای به قطعات بسیار نازک ۵۰ تا ۱۰۰ نانومتری برش می‌دهند. برای دست یابی به کنتراست مناسب، نمونه‌های آماده سازی شده با رنگ‌هایی مثل اسمیک اسید یا نمک‌های پرمنگنات، اورانیوم، لانتانیوم، یا سرب تیمارمی شوند (زیرا این مواد از اتم‌هایی با وزن اتمی بالا تشکیل شده است و الکترون‌ها را به خوبی متفرق می‌کند و کنتراست را افزایش می‌دهد). بعد برش‌ها را روی یک صفحه یا توری فلزی کوچک قرار می‌دهند. پرتوی الکترونی از نمونه عبور می‌کند و نهایتا روی یک صفحه‌ی فلورسانت می‌افتد.

با این روش امکان مشاهده‌ی تک ملکول‌های پروتئین و نو کلئیک اسید نیز وجود دارد. اگر تنها مشاهده‌ی ویژگی‌های خارجی یک نمونه مد نظر باشد، تهیه‌ی برش‌های نازک لازم نیست. سلول‌های دست نخورده یا محتویات آن را می‌توان به طور مستقیم با TEM و به کمک تکنیکی به نام رنگ آمیزی منفی مشاهده کرد.

میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)

روش دیگر برای مشاهده‌ی ویژگی‌های خارجی یک نمونه استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره است. درکار با این میکروسکوپ نمونه با لایه‌ی نازکی از یک فلز سنگین مثل طلا پوشانده می‌شود. سپس یک پرتو الکترونی با حرکت عقب و جلو سطح نمونه را اسکن می‌کنند. الکترون‌های متفرق شده از سطح پوشش فلزی جمع آوری می‌شود و یک صفحه‌ی نمایش را فعال کرده و تولیدتصویر می‌کند. در این میکروسکوپ پرتوی الکترونی از درون نمونه عبور نمی‌کند و معمولا سطح نمونه قابل مشاهده است.

میکروسکوپ مرکب

میکروسکوپ مرکب از یک لوله تشکیل شده که در دو انتهای آن دو عدسی شئی نزدیک به شی مورد مطالعه و عدسی چشمی قرار دارد. تصویری که توسط عدسی شئی بوجود می‌آید، بوسیله عدسی چشمی بزرگتر می‌شود. به این جهت بزرگنمایی آن بیش از قدرت یک عدسی است. در میکروسکوپ‌های پیشرفته، دستگاه نوری پیچیده‌تر است. بدین ترتیب که در آن‌ها علاوه بر لامپ، یک کندانسور (مجموعه عدسی‌های متمرکز کننده نور) و یک دیافراگم که شدت نور را کنترل می‌کند، قرار داده شده است. لامپی که در این نوع میکروسکوپ‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، با ولتاژ کم کار می‌کند. لامپ‌های فراوانی برای این منظور وجود دارند که هرکدام نوری با شدت و طول موج مورد نظر تامین می‌کنند؛ بنابراین برای تفکیک دو نقطه نزدیکتر از ۲۵۰۰ آنگستروم باید از میکروسکوپ الکترونی استفاده کرد.

زیرا طول موج الکترون از طول موج نور کمتر است. اولین میکروسکوپ الکترونی که ساخته شد، درست مانند میکروسکوپ نوری که شعاع نور را از داخل نمونه مورد مطالعه عبور می‌دهد، شعاع الکترون را از داخل مقطع بسیار نازکی عبور می‌دهد.

زیرا تراکم مواد در تمام قسمت‌های نمونه مورد مطالعه یکسان نیست، میزان الکترونی که از قسمت‌های مختلف عبور می‌کند متفاوت است و درنتیجه تصویری از قسمت‌های تاریک و روشن آن بدست می‌آید. میکروسکوپ الکترونی دارای یک قسمت لوله‌ای شکل است که الکترون می‌تواند آزادانه از آن عبور کند و در قسمت بالای لوله یک قطب منفی الکتریکی به شکل رشته سیم نازک وجود دارد که جنس آن از تنگستن است. این قسمت آنقدر حرارت داده می‌شود تا بتواند از خود الکترون آزاد کند.

این عمل با ایجاد اختلاف پتانسیل از ۲۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ ولت بین کاتد و آند صورت می‌گیرد. در نتیجه یک شعاع الکترونی بسوی پایین قسمت لوله‌ای شکل شتاب داده می‌شود. به این سیستم تفنگ الکترونی می‌گویند و در طول لوله عدسی‌هایی همگرا اندازه و روشنایی شعاع الکترونی را قبل از برخورد با نمونه مورد مطالعه کنترل می‌کنند. مقطع مورد بررسی روی یک صفحه مشبک دایره شکلی قرار داده می‌شود. 

شعاع الکترونی پس از عبور از مقطع و قبل از این که به حد بزرگنمایی نهایی برسد، از میان عدسی‌هایی شئی عبور کرده و تنظیم می‌شود. سپس توسط عدسی‌هایی بر روی صفحه زیر میکروسکوپ منعکس می‌شود. چگالی بزرگنمایی بیشتر میکروسکوپ‌ها از ۵۰ تا ۸۰۰۰۰۰ برابر است. صفحه زیر میکروسکوپ از مواد فسفردار (فسفید روی) پوشانیده شده که در مقابل پرتو الکترون از خود نور تولید می‌کند. در زیر این صفحه یک دوربین عکاسی قرار دارد که از تصویر روی صحنه عکس می‌گیرد.

میکروسکوپ فلورسانت (fluorescent microscope)

انواع خاصی از میکروسکوپ نوری که منبع نور آن پرتو‌های فرابنفش است. برای مشاهده نمونه زیر این میکروسکوپ‌ها بخش‌ها یا ملکول‌های ویژه داخل سلول با مواد فلورسانت یا نورافشان رنگ آمیزی می‌شوند. زمانی هدف تشخیص پروتئین‌های خاص یا جایگاه آن‌ها در سلول باشد، روش‌های معمولی رنگ آمیزیکه پروتئین‌ها را به طور عام رنگ می‌کنند قابل استفاده نیست.

برای رنگ آمیزی اختصاصی، معمولا از پادتن‌های اختصاصی متصل به مواد فلورسانت استفاده می‌شود. مواد فلورسانت نور را در طول موج فرابنفش جذب می‌کنند و در طول موج بلندتری در طیف مرئی تابش می‌کنند. تصویری که دیده می‌شود حاصل نور تابش شده از نمونه است. جالب است بدانید؛ رودامین و فلورسئین دو نوع از رنگ‌های معمول فلورسانت هستند که به ترتیب نور قرمز و سبز از خود تابش می‌کنند.

میکروسکوپ اختلاف فاز (phase contrast microscope)

مزیت میکروسکوپ اختلاف فاز در این است که می‌توانیم با آن سلول‌های زنده را با جزئیات بیشتر مشاهده کنیم. تیمار‌هایی مثل تثبیت نمونه می‌توانند دگرگونی‌هایی در ساختار درونی سلول بوجود آورند؛ بنابراین مطاله سلوله‌های زنده که هیچ تیماری ندیده اند خیلی مطلوب است. می‌توان فرایند‌هایی مثل تقسیم میتوز (mitosis) در سلول‌های زنده را نیز با این میکروسکوپ‌ها مطالعه کرد.

در برخی موارد برای عکس برداری پیوسته و دراز مدت از سلول فعال، دوربینی به میکروسکوپ وصل می‌شود. مطالعه سلول‌های زنده با میکروسکوپ تداخلی (interference microscope) و میکروسکوپ زمینه سیاه (dark field microscope) نیز مقدور است. سیستم‌های نوری خاصی در تمام این نوع میکروسکوپ‌ها وجود دارد که به علت ویژگی آن‌ها تباین کافی بین اجزای سلول ایجاد و مشاهده‌ی سلول‌های زنده مقدور می‌شود. استفاده از میکروسکوپ زمینه سیاه برای مشاهده‌ی حرکت باکتری معمول است، که در این مورد ایجاد تباین بین سلول باکتری زنده و محیط اطرافش مهم است.

میکروسکوپ الکترونی نگاره (scanning electron microscope)

نوع ساده‌تر میکروسکوپ الکترونی است برای بررسی نمونه با این میکروسکوپ، نمونه با لایه‌ای نازک از فلز سنگین به صورت یکنواخت پوشیده شود. الکترون‌های تابیده شده به سطح نمونه از هیچ ناحیه‌ای از آن عبور نمی‌کنند، بلکه در برخورد با سطح نمونه باعث تولید الکترون‌های بازتابیده می‌شوند.

این الکترون‌ها تشخیص داده شده و تصویری سه بعدی از سطح نمونه حاصل می‌گردد و قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی نگاره حدود nm۱۰ است.

میکروسکوپ STM و میکروسکوپ پرتو X

STM حروف اول Scanning Tunneling Microscope است این نوع میکروسکوپ در دهه ۱۹۷۰ اختراع شد و مخترعان آن در سال ۱۹۸۱ جایزه نوبل را دریافت کردند و همانطور که گفته شد طول موج محدودیتی برای میزان R. تعیین می‌کند. نوآوری STM در این است که در آن امواج نوری یا امواج نوع دیگر به کار گرفته نمی‌شودو هیچ نوع عدسی در آن وجود ندارد.

بیان دقیق نحوه کار این میکروسکوپ خارج از توان این مطلب است، ولی به طور خلاصه سوندی که نوک آن به اندازه یک اتم است، ویژگی‌های نمونه را در ابعاد اتمی روبش می‌کند. STM ساختار سطحی نمونه را بررسی می‌کند. اما میکروسکوپ مشابه دیگر ویژگی‌های الکتریکی، مغناطیسی و یا دمای نمونه را تعیین می‌کنند و در حال حاضر این میکروسکوپ‌ها برای نمونه‌های زیستی و بیشتر برای نمونه‌های غیر زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

میکروسکوپ پرتو X  نوع دیگری از میکروسکوپ‌های نوین است که کاربرد بیشتری برای نمونه‌های زیستی دارد و قدرت جداسازی آن چند صد آنگسترم و ضعیفتر از میکروسکوپ الکترونی است، اما سلول‌های زنده با آن قابل بررسی هستند.